Forschungszentrum Karlsruhe - Wissenschaftliche Berichte - FZKA 7456

Partikelexpositionen von Zellkulturen: Untersuchungen zur Rolle von Lipidmediatoren bei der inflammatorischen Antwort

Susanne Fritsch-Decker

Zusammenfassung
Zahlreiche epidemiologische Studien zeigen einen Zusammenhang zwischen der akuten Belastung mit Feinstaub (PM) und dem Auftreten von Lungen- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen sowie ansteigenden Sterblichkeitsraten. Die dabei zugrunde liegenden biologischen Wirkungen und die molekularen Mechanismen sind bis heute aber noch weitestgehend ungeklärt.

Das Ziel dieser in vitro Studien war es daher sowohl die Mechanismen inflammatorischer und oxidativer Prozesse nach Partikelexposition zu untersuchen als auch deren Verbindung zueinander aufzuklären. Dabei wurden Flugstaubpartikel aus einer Hausmüllverbrennungsanlage (MAF02) als Modell für verbrennungsgenerierte Umweltpartikel eingesetzt. Da Makrophagen, neben Epithelzellen, wichtige Zielzellen der Lunge repräsentieren, wurden zur Untersuchung partikel-induzierter Effekte die murine Makrophagen-Zelllinie RAW264.7, primäre humane Makrophagen aber auch ein aus Makrophagen und Epithelzellen bestehendes Kokultursystem verwendet.

Flugaschepartikel induzierten in Makrophagen oxidativen Stress, welcher durch die Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies, die Bildung und Freisetzung von 8-Isoprostan, durch eine Erhöhung des intrazellulären Glutathion-Gehaltes, durch eine Akkumulation des Transkriptionsfaktors Nrf2, aber auch durch die Induktion des antioxidativen Hämoxygenase-1 Proteins charakterisiert war.

Des Weiteren wurde, als wichtiger Teil der inflammatorischen Antwort, die Freisetzung der Arachidonsäure und deren Metabolisierung zu Prostaglandin E₂, ein Vertreter inflammatorischer Mediatoren, nach Partikelbehandlung gezeigt. In Korrelation erfolgte dabei ein Anstieg des Cyclooxygenase-2 Proteins. Interessanterweise konnte in einem realistischeren Kokultursystem mit Makrophagen und Epithelzellen eine synergistisch erhöhte Arachidonsäurefreisetzung im Vergleich zur jeweiligen Monokultur beobachtet werden. In Makrophagen zeigte die Mobilisation der Archidonsäure eine Calcium-Abhängigkeit, was durch den Einsatz der Calciumchelatoren BAPTA/AM und EGTA belegt wurde. Ferner wurde anhand von Inhibitor-Versuchen demonstriert, dass die Flugasche-induzierte Freisetzung der Arachidonsäure vom ERK1/2 und JNK1/2, aber nicht vom p38 MAPK (mitogenaktivierte Proteinkinase) Signalweg abhängig ist. Ausgehend von dieser Beobachtung konnte auf Proteinebene die mit der Aktivierung verbundene Phosphorylierung der ERK1/2 und der JNK1/2 nachgewiesen werden. Des Weiteren bewiesen Studien mitspezifischen Inhibitoren eine Beteiligung der zytosolischen Phospholipase A₂, jedoch nicht der sekretorsichen und calcium-unabhängigen Phospholipase A₂, an der Flugasche-induzierten Arachidonsäuremobilisation. Die Fähigkeit von MAF02 Partikeln oxidativen Stress zu induzieren und Signalwege, die den Arachidonsäuremetabolismus betreffen, zu aktivieren korrelierte mit der gesteigerten Aufnahme von Partikeln in das Zytosol von Makrophagen. Dabei lagen die Partikel sowohl einzeln als auch in Membraneinschlüssen im Zytosol der Makrophagen vor.

Interessanterweise ließ sich die Phosphorylierung von ERK1/2 und JNK1/2 durch den Einsatz des Antioxidanzes, N-Acetylcystein, deutlich reduzieren. Darüber hinaus erfolgte eine N-Acetylcystein-abhängige Inhibierung der Arachidonsäurefreisetzung, woraus erneut geschlossen wird, dass die Aktivierung von ERK1/2 und möglicherweise JNK1/2 an der Arachidonsäurefreisetzung beteiligt sind. Die MAF02-induzierte Induktion der Cyclooxygenase, der Hämoxygenase-1 und die Akkumulation von Nrf2 in der Zelle ließen sich ebenfalls durch NAc hemmen.

Zusammenfassend betrachtet belegen diese Studien, dass Flugstaub nach intrazellulärer Aufnahme inflammatorische Prozesse durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies initiiert, was zu einer Aktivierung von Signaltransduktionskaskaden und zu einer verstärkten Expression antioxidativer und inflammatorischer Gene führt. Dabei bewirkten zelluläre Interaktionen von Makrophagen und Epithelzellen eine verstärkte Reaktion in Bezug auf die Arachidonsäuremobilisierung nach Flugstaubbelastung. Somit scheint zelluläre Kommunikation entscheidend zur Entwicklung von partikel-induzierten Erkrankungen beizutragen.

Particle exposure of cell cultures to study the role of lipid mediators during the inflammatory response

Abstract
Acute exposure to elevated levels of environmental particulate matter (PM) is associated with increasing morbidity and mortality rates. These adverse health effects, e.g. culminating in respiratory and cardiovascular diseases, have been demonstrated by a multitude of epidemiological studies. However, the underlying cellular and molecular mechanisms are not yet completely understood.

The main focus of the present in vitro study was to understand the interaction of the generation of reactive oxygen species (ROS) with the induction of antioxidant and inflammatory responses. Incinerator fly ash, also called MAF02, was used as a model for combustion derived particulate matter. As macrophages, besides epithelial cells, are the major targets of particle actions in the lung murine RAW264.7, primary human macrophages as well as a coculture system with RAW264.7 macrophages and LA-4 epithelial cells were investigated.

The interaction of fly ash particles with macrophages induced oxidative stress, indicated by ROS-generated H₂DCF oxidation, formation and release of 8-Isoprostane, increased intracellular glutathione contents, elevated amounts of the transcription factor Nrf-2 and the antioxidative protein heme oxygenase-1.

As part of cellular inflammatory responses I could observe an increasing amount of free arachidonic acid, cyclooxygenase-2 protein and prostaglandin E₂. Interestingly in a co-culture system consisting of macrophages and epithelial cells the mobilisation of arachidonic acid was enhanced due to a synergism of these two cell types. The arachidonic acid liberation depends on an elevated intracellular calcium concentration since the pre-treatment of macrophages with calcium chelators (BAPTA/AM and EGTA) prevented the MAF02-mediated enhancement of free arachidonic acid. Additionally, arachidonic acid mobilisation was blocked significantly by an ERK1/2 pathway-specific inhibitor, while inhibition of p38 MAPK (mitogenactivated protein kinase) had no effect. In correlation the ERK1/2, but not p38 MAPK phosphorylation/activation was observed. Using the specific inhibitor for phospolipases A₂ arachidonic acid liberation was shown to be dependent on the cytosolic phospholipase A₂, but not on the secretory and calcium-independent phospholipase A₂. The ability to induce oxidative stress and several signallingpathways was related to the uptake of MAF02 in macrophages as demonstrated by the transmission electron microscopy.

Interestingly pre-treatment of macrophages with N-Acetyl-cysteine (NAc) blocked the MAF02-induced ERK1/2 and JNK1/2 activation. Furthermore, the increase of free arachidonic acid was reduced in a NAc-dependent manner, indicating an involvement of ERK1/2 and JNK1/2 MAPK signalling pathways in arachidonic acid liberation. NAc had also a reducing effect on the MAF02-generated up-regulation of Cyclooxygenase-2 and heme oxygenase-1 protein as well as the accumulation of Nrf2 in the cytosol of macrophages.

In conclusion, after particle uptake one of the primary mechanism initiating inflammatory processes by incinerator fly ash particles seems to be the generation of ROS, which trigger the activation of downstream signalling and gene expression. Focusing of arachidonic acid mobilisation, the co-culture system with macrophages and epithelial cells was more sensitive in comparison to mono-cultures of the cell lines. These results confirm that intercellular communications play an important role in the pathogenesis of particles-induced diseases.

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